「 解旋活性更强 」 「 解旋速度更快 」
「 热稳定性更佳」
（图1引自Arslan S , Khafizov R , Thomas C D ,et al.Engineering of a superhelicase through conformational control[J].Science, 2015, 348(6232):344.）
SHARP是由Taekjip团队开发而成。他们从嗜热脂肪芽孢杆菌Bacillus stearothermophilus中分离出PcrA酶并对其进行改造成为一种具有更强速度和加工能力的PcrA M6解旋酶，以其代替常规PCR过程中的加热步骤，同时又能保持所需的PCR特性。解旋酶是一类利用水解ATP的能量解开DNA双链之间的氢键使其成为单链的酶。一直以来科研工作者们对解旋酶的作用机制和活性调节都十分感兴趣。
通过对与PcrR同源的Rep酶研究发现，Rep酶的一个柔性域2B可以进行旋转，从而在开放和关闭两种构象之间转换（图1A）。设计两种突变体Rep-X和Rep-Y分别对应关闭和开放状态。实验结果显示X解旋能力更强，表明处于闭合构象时该酶能够实现增强解旋的能力。
那么作为同源的PcrA是否也以同样的机制获得解旋活性呢？PcrA在质粒复制中起着重要作用，在起始蛋白RepD存在的情况下解开环状质粒。实验证明PcrA单体在体外不具有解旋酶活性，但是改造为闭合状态的PcrA-X和Rep-X相似，显示出强的解旋活性。且进一步改造的PcrA M6，解旋活性相比于PcrA-X更强，同时解旋速度也提高了4倍。在通过对大量解旋酶的测定之后，在可能应用于SHARP的七种候选解旋酶脱颖而出（图2）。
（图2引自Gavrilov M , Yang J Y C , Zou R S ,et al.Engineered helicase replaces thermocycler in DNA amplification while retaining desired PCR characteristics[J].Nature Communications，2022,13,6312.）
综合了解旋活性、反应温度以及其他条件，PcrA M6作为最优解成为SHARP技术中的关键组分。和PCR体系类似，SHARP体系自然也需要聚合酶的作用，对比Bst-LF DNA聚合酶、Bsu、Klenow Exo-、phi29、反转录酶M-MLV、AMV等酶，Bst-LF DNA聚合酶对于SHARP体系最好，由此另一个关键酶也确定下来。同时，体系中还需要添加单链结合蛋白SSB，否则扩增无法进行（图3，f），这是因为PcrA M6需要DNA的3’端是单链才能进行解旋，而加入SSB之后，对于平末端或环状的质粒，PcrA M6就也可以进行解旋了。因此，最终的SHARP体系包括模板，一对引物（250 nM）, dNTPs，Bst-LF DNA聚合酶， SSB，ATP，热稳定无机焦磷酸酶。
· 扩增产物长度更长，可达6000bp
· 引物设计更简单
· 加入荧光染料可进行实时检测
· 扩增产物可用于测序、克隆等下游实验
· 扩增时间只需5-30min，无需初始热变性，检测浓度更低
（图3引自Gavrilov M , Yang J Y C , Zou R S ,et al.Engineered helicase replaces thermocycler in DNA amplification while retaining desired PCR characteristics[J].Nature Communications, 2022,13,6312.）
另外SHARP可以在37-65℃这样一个更宽范围的温度条件进行恒温扩增，因为PcrA M6具有很好的热稳定性保证其在一个宽泛的温度范围内都具有解旋活性。不过需要注意的是，如果在37℃进行，那么使用Bsu或Klenow Exo-会比使用Bst-LF DNA聚合酶效果更好，并且模板的长度需要在1 kb以内，扩增时间也需要延长至1小时以上。
综上所述，SHARP技术在分子诊断领域可能拥有更广阔的应用前景，同时它还可以用于确定人类细胞内CRISPR-Cas9基因组编辑的水平，并且可以检测和扩增易于形成二级结构的序列。有理由相信，在未来SHARP也许也可以实现在环境筛查、农业害虫检测和其他以消费者为中心的家庭诊断测试等行业中的常规应用。
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参考文献：
[1]. Arslan S , Khafizov R , Thomas C D ,et al.Engineering of a superhelicase through conformational control[J].Science, 2015, 348(6232):344.
[2]. Gavrilov M , Yang J Y C , Zou R S ,et al.Engineered helicase replaces thermocycler in DNA amplification while retaining desired PCR characteristics[J].Nature Communications, 2022,13,6312
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