新品介绍—重组酶聚合酶扩增反应(RPA)

发布日期:
2022-06-27
RPA


核酸体外扩增是分子生物学、遗传学、医学等研究领域最常用的技术之一。其中聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)以及在此基础上发展的多重PCR、单分子PCR、实时荧光定量PCR等技术使用最为广泛,但这些技术均依赖于控温准确的热循环仪器,限制了其在临床现场检测中的应用。


核酸恒温扩增技术由于不需反复热变性,无需特殊仪器,反应速度更快,适合现场快速检测,在生命科学研究及相关诸多领域已经得到了广泛应用。


新品介绍—重组酶聚合酶扩增反应(RPA)




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新品介绍—重组酶聚合酶扩增反应(RPA)


新品介绍—重组酶聚合酶扩增反应(RPA)





01.

 RPA重组酶聚合酶扩增技术是什么呢?



新品介绍—重组酶聚合酶扩增反应(RPA)

重组酶与引物结合形成的蛋白-DNA复合物,能在双链DNA中寻找同源序列。一旦引物定位了同源序列,就会发生链交换反应形成并启动DNA合成,对模板上的目标区域进行指数式扩增。被替换的DNA链与SSB结合,防止进一步替换。在这个体系中,由两个相对的引物起始一个合成事件。整个过程进行得非常快,一般可在十分钟之内获得可检出水平的扩增产物。



02.

 RPA技术也要依赖这三种酶



能结合单链核酸(寡核苷酸引物)的重组酶: 负责结合引物并替换模板链;

单链DNA结合蛋白(SSB): 结合被替换链并防止其进一步被替换;

链置换DNA聚合酶: 负责DNA链的合成。

这三种酶的混合物在常温下也有活性,最佳反应温度在37°C左右。



03. 

依赖后有了特性的RPA,超抢手



速度快,RPA在37~42°C的最佳反应温度下,通常可以在3~10分钟内将核酸样本被扩增到可检测的水平。在许多情况下,一个没有经过专业培训的操作员,在半小时内就能完成取样、准备样品、运行检测并获得结果。


检测灵敏度高,RPA可以检测复杂样品中的DNA单个拷贝和RNA数十个拷贝或更少,通常无需事先进行核酸纯化。


特异性高,RPA是如此特异,以至于该技术可以检测和扩增复杂样本中存在的单拷贝DNA分子,该样本可能含有数百纳克来自多种多样物种(包括人类DNA)的无关复杂DNA。


无需昂贵的配套设备,qPCR采用的是Taq DNA聚合酶,其实现扩增必须经过95°C、60°C的温度循环,而RPA为恒温反应,一个水浴锅即可完成,因此其检测方法无需复杂昂贵的温控设备,更为方便快捷。


耐受性好,RPA对样本类型非常宽容,在某些情况下可以直接作用于复杂的样本,如血液、鼻腔拭子或培养基,这些样本无需经过核酸纯化。


适用性广泛,RPA可以很容易地应用于任何DNA或RNA靶标。可以通过向反应混合物中添加逆转录酶来开发超高灵敏度的一管式RNA检测分析。


可做多重检测,通过在同一反应管中组合多个引物,单次RPA试验可用于多个不同目标的扩增和检测。


检测方法多种多样,RPA可以应用于多种检测系统和仪器,包括荧光、探针、检测试纸条等。



04. 

RPA反应扩增产物检测方式



RPA扩增产物可以通过多种方式检测,如结合化学发光检测表面增强拉曼散射等方式检测RPA扩增产物,其中最经典的3种检测方式为实时荧光检测侧向层析试纸条检测反应(lateral flow dipstick,LFD)凝胶电泳检测。



05. 

RPA技术应用领域



  • 绝对定量

  • 病原微生物检测

    病毒检测

    细菌检测

    真菌检测

    寄生虫检测

  • 基因突变检测

  • 融合基因检测

  • 食品安全检测


参考文献:景志刚董浩狄栋栋田莉莉范伟兴重组酶聚合酶扩增技术研究进展[J]. 生物技术通报, 2016, 32(6): 47-53




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