技术原理

RNA干扰（RNAinterfering，RNAi）现象是由与靶基因序列同源的双链RNA（double-strandedRNA，dsRNA）引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。细胞中的核糖核酸酶III家族成员之一的，dsRNA特异性的核酸酶Dicer将dsRNA裂解成由21-25个核苷酸组成的小干扰RNA(smallinterferingRNA，siRNA)，随后siRNA作为介导子引起特异性地降解相同序列的mRNA，从而阻断相应基因表达的转录后基因沉默机制。

1、公司提供的 siRNA 是双链的还是单链的？

公司的 siRNA 是双链的，而且也是按照双链来定价的。

2、我们需要提供什么信息用于 siRNA 的合成？你们可以帮助免费设计

吗？

您需要准确地提供 siRNA 的 19 个核昔酸的靶序列和悬垂的合成物，或者您也可以提供相应地基因的 GeneID 或者 Accession Number，由我们公司技术人员为您免费设计。

3、如何选择 siRNA 的悬垂组成？

悬垂的序列组成是由顾客自行选择的。最近研究表明悬垂的组成在mRNA 靶识别和酶解中不是很重要。悬垂可能在形成 RISC 的过程中起结构的作用。很多研究人员选择 dTdT 是因为研究表明脱氧核糖核昔能保护 siRNA 免受酶解。合成序列最重要的是确定靶mRNA 的 19 个碱基的核心结构。

4、针对人体基因设计的 siRNA 对其他物种是否也有效？

一般 siRNA 都具有物种特异性，很少与其他物种有相同的靶位点，所以针对人体基因设计的 siRNA 不会沉默其他物种的同源序列。然而，也有研究表明 siRNA 经过特异性设计后能对两个或两个以上的物种有效，这需要仔细进行 siRNA 设计和生物信息学分析。

5、你们提供的 siRNA 是怎样装运的？如果在常温下放置了一个星期，还有效吗？

公司为您提供的 siRNA 是冻干粉包装的，在常温下运输。这些冻干的样品在室温下能稳定保存 2-4 个星期，所以放置一个星期不会影响其沉默效果。但我们建议您收到样品后最好保存于-20℃或-70℃有霜冷冻箱中。

6、在体外实验中，需要多少量的 siRNA？

我们建议您用于实验的 siRNA 的浓度为 100nM。1nmol siRNA 的量对于一个 24 孔板或是 96 孔板的实验已经足够了。

7、用 100nM 的 siRNA 转染时只得到 50%沉默效率，我可以将 siRNA的浓度增加到200nM 甚至 400nM 吗？

增加 siRNA 的浓度一般不能改进沉默效率。高浓度的 siRNA 将可能导致去靶作用和对细胞的毒性。siRNA 的高基因沉默效率来自于合理的设计，在 100nM 甚至更低的浓度都可能有 75%的沉默效率。另外，低的转染效率会导致低的沉默效率，建议您更进一步优化

siRNA 的导入条件。

8、定量 RNA 的公式是什么？

研究者可以用 Beer 法则定量 RNA：吸光度(260nm)=(摩尔消光系数)*(浓度)*(路径氏度，cm)。为了便于理解，等式变为：浓度＝(吸光度，260nm)/[(摩尔消光系数)*(路径氏度，cm)]。当使用一个标准的10mm 比色皿时，在公式中路径氏度这个变量等于1。

6μl 浓度为 10uM 的 siRNA 溶解液中含有多少μg 的 siRNA？

首先计算含有多少 nmol 的 siRNA：

a. 等式: ?nmol=(6μl)(10umol/L)；

b. 单位换算: ?nmol= (6μl)(10μmol/L)(1L/1,000,000μl)(1,000nmol/μmol)；

c. 答案: ?nmol=0.06nmol。

然后利用 siRNA 的平均分子量(13,300g/mol)*nmol 变为μg：

a. 等式: ?μg=(0.06nmol)(13,300g/mol)；

b. 单位换算: ?μg=(0.06nmol)(13,300g/mol)(1mol/1,000,000,00 0nmol)(1,000,000μg/g)；

c.答案: ?μg=0.798 约 0.8μg。所以 6μl 浓度为 10μM 的 siRNA 溶解液中含有 0.8μg的siRNA。

9、我需要浓度为 20uM 的样品，如何计算重悬 siRNA 缓冲液的量？

样品浓度的计算如下：(siRNA 的量，nmol)/(重悬体积，μl)＝样品浓度，μmol/L。在解答前应先统一单位，确保单位可以抵消。例如：您购买了 20nmol 的 siRNA，想溶解为50μM 的样品。可按以下方法计算重悬缓冲液体积：a.等式: (20 nmol)/?μl=50umol/L；b.解答未知量 : ?μl=(20nmol)(1L/50umol) ；

c. 单 位 换 算: ?μl=(20nmol)(1L/50μmol)(1μmol/1,000nmol)(1,000,000μl/1L)；

d.答 案: ?μl=400μl。因此，应该使用 400μl 缓冲液去重悬 20nmol 的siRNA，溶解后为 50μM 的样品。

10、一定需要阴性对照吗？

是，阴性对照是 RNA 干扰实验中不可缺少的。由于在超过 200nM 的浓度下，siRNA 有可能会导致非特异性的压力反应，在实验体系中必需设置阴性对照。它能够帮助我们确认基因表达水平的降低是否是序列特异性的 RNAi 的结果。由于 siRNA 的合成方法和工艺以及转染试剂等因素可能导致广泛的基因沉默现象。如果没有阴性对照，研究人员很可能错误地将广泛的、非特异性基因沉默当作由 RNAi 引起的基因特异性沉默。

11、常用的阴性对照有哪些类型？

常用的阴性对照大体分为两种，一种是使用通用阴性对照序列，该序列已经被上千篇文章使用；另一类是使用和靶基因 siRNA 打乱序列的 siRNA 作为阴性对照，这样的阴性对照和通用序列相比较，一方面合成是按照定制产品价格合成的，另一方面，由于打乱序列是没有经过验证的序列，有可能会产生 off target 现象。因此，除非有非常特殊的要求，最好使用通用序列作为阴性对照。

12、在阴性对照体系中和实验体系中观察到同样的实验结果，这是什么原

因？

这个结果充分说明了设置阴性对照的必要性。该结果表明您所观察到的表型不是序列特异性 knockdown 产生的表型，您需要降低 siRNA 的工作浓度。为什么说阳性对照在 RNA 13、干扰实验中很重要？

阳性对照作为一个实验系统检查是很重要的。也就是说，当您看到siRNA 阳性对照的预期实验结果时，您能确保在您的实验方法中您的转染、RNA 提取物和检测方法是可靠的。通常最好的阳性对照是内在的对照。

14、你们能提供预先合成的 siRNA 对照么？

可以。吉玛能提供许多预先合成的用于 RNA 干扰实验的对照双链。

15、用于对照的 siRNA 的最佳浓度是多少？

阳性对照和阴性对照的 siRNA 的浓度都应该与基因特异性的 siRNA的浓度相同。

16、在 siRNA 上进行标记的最佳位点在哪里？

反义链的 5'端标记会影响 siRNA 的沉默活性，所以不推荐标记这个位点。在其他三个末端进行标记对沉默活性几乎没有影响。有研究表明正义链的 5'端标记是最有效的化学合成位点。

17、荧光标记的 siRNA 是不是可以作为良好的对照？如何检测荧光标

记的 siRNA？

已经有为数不少的实验室研究过荧光标记的 siRNA 的荧光检测结果和 knockdown 效率之间的正相关关系。荧光标记双链是最常用的优化转染条件的方法。可以用流式细胞仪或者荧光共聚焦显微镜检测标记的 siRNA。

18、荧光素的最大吸收率和収射率各在哪个波段？

荧光素在 495nm 处有最大吸收率，在 520nm 处有最大发射率。

19、如何筛选转染试剂？

好的转染试剂有以下特点：

1. 对 siRNA 有较高的转染率；

2. 对细胞的毒性小。在mRNA水平检测 siRNA 导入的效果比用看家基因的siRNA阳性对照检测更为准确。

20、转染过程中发现大量细胞死亡，我应该如何处理？

如果出现细胞大量死亡，意味着您的转染条件仍然需要优化：转染条件的优化一般包括以下几个方面：

1.调整转染试剂的浓度；

2.在转染后适当的时间内更换无转染试剂的培养液；

3.调整细胞的生长状态：一般处于良好生长状态的细胞对转染试剂就有更好的耐受性；

4.调整转染试剂和 siRNA 的比例：如果同一管转染试剂在不同实验中对细胞的毒性有差异，一般说来应该是实验过程本身带来的差异：如果已经做了以上几项工作，转染效率仍然得不到提高，建议您更换一种转染试剂。

21、如何将 siRNA 导入到细胞内？

使用什么样的转染方法，很大程度上取决于您使用的细胞系：

1.贴 壁的、易转染的细胞，我们推荐使用 Lipofectamin 2000 。

2.悬浮的或 原代的细胞，我们推荐使用电击转化方法；

3.电击转化效率仍然很低 的细胞，需要选择载体系统。公司除提供化学合成的 siRNA 以外，还提供完整的载体系统，请参阅产品资料。

22、我的课题主要是研究细胞凋亡相关基因，我手上有一些新基因需要使用 RNA干扰进行深入研究，我该如何选择对照系统？

用 RNAi 进行 pathway 研究，是 RNAi 主要应用之一。在这样的课题中，对照系统的选择尤其重要。已经发表的和已经验证的 siRNA为RNA 干扰研究提供了系统性对照。用 RNAi 进行细胞凋亡相关基因的研究，以往已经有众多的文献报道，可以查阅公司已发表的文献。

23、我刚刚开始接触 RNA 干扰技术，从文献上看，不同细胞应该选用不同的转染试剂，不同的研究目的，应该使用不同的 siRNA，我的 经费有限，如何有效确定我的研究体系？

在开始 RNA 干扰研究之初，需要确定以下几个方面：使用化学合成 的 siRNA 还是使用载体构建 shRNA？我们推荐您使用化学合成的方法来筛选有效的目的片段，然后把您筛选出来的目的片段插入到载体，进行抗性筛选，得到稳定表达的细胞株，再做长期研究。