PCR系列-抗体染料法定量PCR预混液(通用)
PCR系列-抗体染料法定量PCR预混液(通用)

PCR系列-抗体染料法定量PCR预混液(通用)

Taq qPCR Premix (Universal)是 SYBR® Green I 嵌合染料法专用 qPCR 试剂,为 2× 预混液,包含除引物和 DNA 样品以外的所有 qPCR 组分,可减少操作步骤,缩短加样时间,降低污染几率。



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DQ00201Taq qPCR Premix (Universal)抗体染料法定量PCR预混液(通用)2 ×,4 ml888

Taq qPCR Premix (Universal)是 SYBR® Green I 嵌合染料法专用 qPCR 试剂,为 2× 预混液,包含除引物和 DNA 样品以外的所有 qPCR 组分,可减少操作步骤,缩短加样时间,降低污染几率。其核心组分是经抗体修饰的热启动 Taq DNA 聚合酶,配合精心优化的 Buffer 体系以及 PCR 反应促进因子,使产品具有特异性强、扩增效率高等特点,有效抑制非特异性扩增,可对宽广浓度范围的模板进行准确定量,获得稳定可靠的 qPCR 结果。


染料法经济实惠,可以做溶解曲线,分析全部PCR产物的TM值



               问题描述



                        可能原因

 


                                                                     解决办法

 

扩增曲线不光滑


    荧光信号太弱,经系统校正后产生

 


确保 Mix 中预混的染料未降解;更换荧光信号收集更好的 qPCR 专用耗材

扩增曲线断裂或下滑

 


模板浓度较高,基线的终点值大于 Cq 值



减小基线终点 (Cq 值 -4), 重新分析数据

个别孔扩增曲线突然骤降

反应管内留有气泡

确保 Mix 完全溶解,请勿涡旋振荡混匀

加样完成后轻弹离心去除气泡

延长预变性时间至 10 min,以去除气泡

反应结束无扩增曲线出现

反应循环数偏少


设置循环数为 40,但更多的循环数会增加过多的背景信号


荧光信号采集步骤未设置或者设置错误


两步法扩增程序一般将信号采集设置在退火& 延伸阶段,三步法扩增程序应 当将信号采集设置在 72℃延伸阶段

 

引物可能降解


长期未用的引物,应先通过 PAGE 电泳检测完整性,以排除其降解的可能

 


                       模板浓度过低

 


减少模板稀释倍数重复实验,样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起

 


                          模板降解

 


重新制备模板,重复实验

 

Cq 值出现过晚

扩增效率低


提高引物浓度,尝试三步法扩增程序,或者重新设计引物

 

模板浓度过低


减少模板稀释倍数重复实验,样品浓度未知的情况下先从最高浓度做起

 

模板降解


重新制备模板,重复实验

 

扩增产物过长 

扩增产物长度控制在 80~200 bp

体系中存在 PCR 抑制剂


一般为模板带入,加大模板稀释倍数或重新制备纯度高的模板重复实验

 

空白对照出现信号

反应体系污染


首先更换空白对照的水,如果还发生同样情况,继续更换引物、吸头、PCR 管或启用新的 Mix

反应体系在超净工作台内配制,减少气溶胶污染

出现引物二聚体等非特异性扩增


一般在35 循环以后空白对照出现扩增产物属正常情况,应配合熔解曲线进行分析,重新设计引物,调整引物浓度或优化 PCR 反应程序

 

熔解曲线出现多峰


                        引物设计不佳

 


根据引物设计原则重新设计新引物

 

引物浓度过高

适当降低引物浓度

cDNA 模板存在基因组污染

提取后的 RNA 溶液使用 DNA 酶进行消化,例如:dsDNase,以去除基因组 污染,或设计跨内含子引物

RNA 溶液使用 DNA 酶进行消化,例如:dsDNase,以去除基因组

污染,或设计跨内含子引物

实验重复性差

加样误差大

使用精准的移液器、配合高品质吸头准确移液

高倍稀释模板,加入大体积模板减少加样误差

放大 qPCR 反应体积

模板浓度过低

减少模板稀释倍数重复实验

qPCR 仪不同位置的温度偏差


定期校准 qPCR 仪

 


抗体染料法定量PCR预混液(通用...

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