转化效率低

感受态效率低下

使用新制备或妥善保存的感受态细胞。

DNA片段比例不佳

按照说明书推荐的最适用量和比例配制反应体系。载体和插入片段的浓度测定：若线性化载体与插入片段已经过纯化，且经电泳检测条带单一或无Smear残留时，可使用超微量核酸蛋白检测仪等基于分光光度法的仪器进行浓度测定，但只有当A260/A280在1.8~2.0之间时浓度值可信；若线性化载体与插入片段未经过纯化，也可使用琼脂糖电泳测定样品浓度。

DNA片段纯度不够

对载体和插入片段进行胶回收纯化。由于EDTA等金属离子螯合剂会抑制无缝克隆反应，因此纯化产物应溶解于ddH2O中，切勿使用Tris-EDTA等缓冲液。

反应产物过量

在转化体系中，无缝克隆反应产物体积不应超过感受态细胞体积的10%。

大量克隆不含

插入片段

载体线性化不完全

酶切制备线性化载体时，提高快速内切酶的使用量，延长反应时间，使用胶回 收纯化酶切产物。

相同抗性质粒污染

以质粒为模板进行插入片段 PCR 扩增时，使用预线性化质粒作为扩增模板，使 用 DpnI 等甲基化敏感型内切酶对扩增产物进行处理，或对产物进行胶回收纯化。

平板抗性不足

确保使用正确的抗生素，并使用新鲜制备的抗生素平板。

大量克隆含有

不正确插入片段

非特异性 PCR 扩增产物

优化 PCR 体系，提高扩增特异性，或胶回收纯化 PCR 产物重叠序列的扩增引物。